同種異體軟骨細胞-聚羥基乙酸支架復合物修復甲狀軟骨缺損 喬占清1，張 俊1，馬 賽1，馬振亞1，司遠征1，喬新明2 (1南陽醫(yī)學高等?？茖W校*附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南省南陽市 473058；2鄭州大學基礎學院，鄭州大學*附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，河南省鄭州市 450001) 引用本文：喬占清，張俊，馬賽，馬振亞，司遠征，喬新明. 同種異體軟骨細胞-聚羥基乙酸支架復合物修復甲狀軟骨缺損[J].中國組織工程研究，2016，20(12):1711-1717. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.12.006 ORCID: 0000-0001-7948-8704(喬占清) 文章快速閱讀： 文題釋義： 軟骨組織工程：是將軟骨種子種植于可生物降解、組織相容性好的生物材料上，形成復合物，然后再把該復合物植入軟骨缺損處，在生物材料自行降解的過程中，種植的細胞形成新的軟骨來填充缺損。 自體軟骨移植：Donald等采用異體軟骨移植的方式對不同類型軟骨缺損進行治療，并與自體軟骨缺損的臨床效果進行比較。通過比較發(fā)現，兩種不同的軟骨移植方式在排斥率和感染率方面經比較差異均無顯著性意義。但較之自體軟骨移植，異體軟骨移植存在明顯吸收現象。學者們還認為，如果在臨床治療中利用良好的方法對異體軟骨予以妥善保存，則可顯著降低其移植后的吸收現象，達到與自體軟骨移植相同的治療效果。 異體軟骨移植：鄭信民等通過實驗發(fā)現，利用具有良好活力的同種異體軟骨進行軟骨修復治療可以獲得理想的臨床效果。在將同種異體軟骨植入人體之后，可以維持20年左右的存活時間且很少會出現明顯的吸收現象，臨床修復效果十分理想。 摘要 背景：將聚羥基乙酸支架與軟骨細胞復合，可獲得組織工程人工骨。 目的：觀察同種異體軟骨細胞-聚羥基乙酸支架復合物修復乳兔喉甲狀軟骨缺損的效果。 方法：取新西蘭成年大白兔20只，構建喉甲狀軟骨缺損模型后隨機分組，實驗組于缺損處植入同種異體軟骨細胞-聚羥基乙酸支架復合物，對照組于缺損處植入聚羥基乙酸支架。植入后4，8周進行大體觀察、組織學觀察。 結果與結論：①大體觀察結果：植入后4周，實驗組軟骨缺損得到一定的修復，修復區(qū)域未出現壞死；對照組缺損區(qū)域填充有肌肉和結締組織。植入后8周，實驗組軟骨缺損得到進一步修復，修復界限不明顯；對照組軟骨缺損未得到修復，與周圍正常軟骨之間存在明顯界限。②免疫組織化學染色結果：實驗組植入后4，8周的Ⅱ型膠原表達均高于對照組(P < 0.05)。結果表明同種異體軟骨細胞-聚羥基乙酸支架復合物可促進乳兔喉甲狀軟骨缺損的修復。 關鍵詞： 生物材料；軟骨生物材料；喉甲狀軟骨；軟骨缺損；同種異體軟骨細胞；聚羥基乙酸 主題詞： 甲狀軟骨；軟骨細胞；組織工程 Allogenic chondrocytes-polyglycolic acid compound for repair of thyroid cartilage defects Qiao Zhan-qing1, Zhang Jun1, Ma Sai1, Ma Zhen-ya1, Si Yuan-zheng1, Qiao Xin-ming2 (1Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College, Nanyang 473058, Henan Province, China; 2Basic School of Zhengzhou University, Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China) Abstract BACKGROUND: Tissue-engineered bone can be obtained by the combination of chondrocytes and polyglycolic acid scaffold. OBJECTIVE: To investigate the effect of allogeneic chondrocytes/polyglycolic acid scaffold compound in the repair of thyroid cartilage defects in rabbits. METHODS: Twenty New Zealand adult rabbits were randomly divided into experimental group with implantation of allogeneic chondrocytes/polyglycolic acid scaffold compound and control group with implantation of polyglycolic acid scaffold. Gross and histological observations were done at 4 and 8 weeks after implantation. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Gross observation results: 4 weeks after surgery, cartilage defects in the experimental group were repaired certainly, and no necrosis appeared in the repair area; in the control group, the defects were filled with muscle and connective tissues. At 8 weeks after implantation, cartilage defects in the experimental group were further repaired, with unclear repair boundaries, and in the control group, cartilage defects were no repaired and showed a notable boundary with the surrounding normal cartilage tissues. (2) Immunohistochemical staining results: the expression of type II collagen in the experimental group was higher than that in the control group (P < 0.05) at 4 and 8 weeks after implantation. These findings indicate that the allogeneic chondrocytes/polyglycolic acid scaffold compound can promote the repair of thyroid cartilage defects in rabbits. Subject headings: Thyroid Cartilage; Chondrocytes; Tissue Engineering Cite this article: Qiao ZQ, Zhang J, Ma S, Ma ZY, Si YZ, Qiao XM. Allogenic chondrocytes-polyglycolic acid compound for repair of thyroid cartilage defects. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(12):1711-1717. 0 引言 Introduction 喉是人體中一個十分重要的部位且結構十分復雜，包含多種軟骨類型，包括環(huán)狀軟骨、會厭軟骨、甲狀軟骨和杓狀軟骨等[1]。這些軟骨一同聚集在小小的咽喉通道之中，對喉腔的正常力學狀態(tài)予以支撐和維持。但受到疾病及外傷等諸多因素的影響，極易導致喉部軟骨缺損的出現[2]，對患者的外觀產生一定的影響，引起失音及嗅覺變化等一系列問題[3]。以往修復喉甲狀軟骨缺損時，可采用患者自體軟骨移植方式[4]。Bhavana等[5]曾經利用髂嵴作為移植物，治療喉氣管軟骨缺損，以實現聲門下喉重建。但患者自體軟骨來源十分有限，且在移植時不可避免地會對患者造成新的創(chuàng)傷，導致各種術后并發(fā)癥的出現，影響患者術后恢復[6]。 隨著臨床醫(yī)學的不斷發(fā)展，組織工程學得到了較快發(fā)展，組織工程人工骨的出現也為各種喉軟骨損傷治療提供了新的方法。在進行修復時，需要結合不同患者軟骨缺損的具體情況進行組織人工骨構建。構建過程中需要具備種子細胞和理想的支架材料[7]。受到喉軟骨中空不規(guī)則結構的影響，需要使用良好的細胞外基質支架材料，相應的材料應該具備良好的機械強度、孔隙結構及生物相容性等[8]。 現如今，軟骨組織工程細胞外基質材料主要包括天然生物材料和各種人工合成生物材料等。其中聚羥基乙酸是一種常用的人工合成生物材料，具有良好的生物相容性和孔隙結構，是一種理想的支架材料[9]，將其與軟骨細胞進行復合，可以獲得修復所需的人工骨。此次實驗過程中，從具有免疫力的乳兔體內獲得軟骨細胞，并與聚羥基乙酸進行復合，獲得軟骨修復復合物，對喉甲狀軟骨缺損動物進行軟骨修復治療，以探討同種異體軟骨細胞-聚羥基乙酸復合物對有免疫力乳兔體內喉甲狀軟骨缺損的修復效果。 1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設計 隨機對照動物實驗。 1.2 時間及地點 實驗于2015年7至8月在南陽醫(yī)學高等?？茖W校*附屬醫(yī)院實驗室完成。 1.3 材料 聚羥基乙酸支架材料由廣州市濟源生物科技有限公司提供，原材料為聚乙醇酸，可降解，具有良好的生物相容性。 實驗動物：1周齡純種新西蘭健康乳兔21只，由西安市迪樂普生物資源開發(fā)有限公司提供，許可證號：SCXK(陜)2013-0006，健康狀況良好。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。 試劑與儀器： 1.4 實驗方法 乳兔軟骨細胞的分離和培養(yǎng)[10]：取1只乳兔脫頸處死，在超凈工作臺上于無菌環(huán)境下切下雙膝，放入含雙抗的PBS內。利用眼科剪游離軟骨予，之后添加胰蛋白酶。消化結束之后，添加含雙抗和胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。利用眼科將軟骨剪為小碎塊，添加Ⅱ型膠原酶，置于恒溫箱進行消化，獲得細胞懸液。利用150目網篩進行過濾，將過濾液置于離心管中進行離心，離心結束棄掉上清，添加含雙抗和胎牛血清的培養(yǎng)基，進行機械吹打，之后接種于培養(yǎng)瓶中，進行培原代和傳代培養(yǎng)。取第4代細胞，利用胰蛋白酶進行消化之后接種在96孔板中，連續(xù)培養(yǎng)10 d，添加MTT液進行孵育，添加DMSO溶解結晶物，利用酶聯免疫檢測儀對細胞在492 nm處的吸光度值進行檢測和記錄，根據檢測結果并繪制細胞生長曲線。 聚羥基乙酸支架材料處理：對聚羥基乙酸支架材料進行剪裁，剪為片狀，大小為1.2 cm×1.5 cm。利用多聚賴氨酸對材料進行浸泡，待材料*浸透之后取出，置于自然條件下進行風干。干燥之后利用乙醇浸泡消毒，并使用三蒸水清洗。清洗結束后置于無菌培養(yǎng)皿中自然干燥，妥善保存?zhèn)溆?，并取部分材料進行掃描電鏡觀察。 軟骨細胞復合聚羥基乙酸支架材料：復合之前利用紫外線對支架材料進行照射，之后對軟骨細胞進重懸，調整細胞濃度為6×1010 L-1。將軟骨細胞接種在支架材料上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。之后添加Ham-F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h之后換液。 實驗分組：取20只乳兔，隨機分為對照組和實驗組，每組10只。兩組均構建喉甲狀軟骨缺損模型，具體方法為：利用戊巴比妥對動物進行全麻，把動物固定在手術臺，對動物頸部進行脫毛和術區(qū)消毒，于動物頸部正中做切口，對肌層進行分離，暴露甲狀軟骨，從兩側甲狀軟骨板交界位置將軟骨切開，在一側甲狀骨板上造成0.6 cm×0.5 cm的缺損，連同內外軟骨膜一并去除，保留喉黏膜，制備單側甲狀骨板缺損模型。單側甲狀骨板缺損模型制備完畢之后，實驗組動物植入同種異體軟骨細胞復合聚羥基乙酸支架材料，對照組植入同樣大小的聚羥基乙酸材料。植入結束后進行切口縫合。 術后處理：術后對兩組動物予以耳緣青霉素靜脈注射80×104 U，待動物清醒之后，對動物進行常規(guī)喂食、喂水。術后每天對兩組動物肌肉注射青霉素80×104 U，連續(xù)注射3 d，術后觀察動物一般情況，并進行記錄。 1.5 主要觀察指標 植入后4周和8周，分別處死兩組動物各5只，獲得標本進行觀察，了解喉甲狀軟骨缺損大體情況。利用Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒對兩組Ⅱ型膠原表達情況進行檢測，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，觀察兩組的Ⅱ型膠原表達陽性率，利用圖像分析軟件進行半定量分析。 1.6 統(tǒng)計學分析 實驗所得數據均利用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0進行分析，P < 0.05表示數據間差異有顯著性意義。 2 結果 Results 2.1 實驗動物數量分析 20只乳兔全部進入終結果分析，見圖1。 2.2 聚羥基乙酸支架材料掃描電鏡觀察 對聚羥基乙酸支架材料進行掃描電鏡觀察，可以觀察到支架材料具有良好的孔隙結構，見圖2。 2.3 乳兔軟骨細胞培養(yǎng)結果觀察 對乳兔軟骨細胞進行培養(yǎng)，原代培養(yǎng)1 d，細胞開始貼壁，呈短梭形、圓 形；培養(yǎng)3 d，細胞多呈三角形及多邊形，其胞漿豐富；培養(yǎng)10 d，可觀察到細胞胞漿豐富，細胞之間相互連接，并呈現出“鋪路石”狀，見圖3。 2.4 乳兔軟骨細胞培養(yǎng)體外生長情況檢測 利用酶聯免疫檢測儀對細胞在492 nm處的吸光度值進行檢測和記錄，按照檢測結果繪制細胞生長曲線，見圖4。 2.5 術后動物一般情況分析 術后兩組實驗動物均正常呼吸，呼吸維持在良好的通暢狀態(tài)，未出現喘鳴等情況，正常進食、飲水、活動，術后頸部傷口均一期愈合，未出現感染或死亡。 2.6 標本大體情況分析 植入后4周：實驗組可觀察到軟骨缺損得到一定的修復，修復區(qū)域未出現壞死；對照組缺損區(qū)域填充有肌肉和結締組織。 植入后8周：實驗組軟骨缺損得到進一步修復，修復界限不明顯；對照組軟骨缺損未得到修復，與周圍正常軟骨之間存在明顯界限。 2.7 兩組Ⅱ型膠原表達分析 實驗組植入后4，8周的Ⅱ型膠原陽性率顯著高于對照組(P均< 0.05)，見表1，圖5。 3 討論 Discussion 喉部較易出現軟骨缺損，其中喉甲狀軟骨缺損十分常見，但軟骨的修復能力十分有限[11-13]。國外學者Kim等[14]通過研究指出，對于直徑在3 mm以下的軟骨缺損，可實現全部或者部分修復。但對于直徑在4 mm以上的軟骨缺損，依靠機體自身的修復能力則大多無法自行修復。 在進行軟骨修復時，采用自體軟骨移植是常用的方法，但受到來源和創(chuàng)傷等因素的影響，存在一定的應用局限性[15-19]。隨著組織工程學的不斷發(fā)展，臨床開始積極的通過構建組織人工骨的方式進行軟骨缺損修復治療[20-25]。鄭信民等[26]通過實驗發(fā)現，利用具有良好活力的同種異體軟骨進行軟骨修復治療可以獲得理想的臨床效果。在將同種異體軟骨植入人體之后，可以維持20年左右的存活時間且很少會出現明顯的吸收現象，臨床修復效果十分理想。Donald等[27]也采用異體軟骨移植的方式對不同類型軟骨缺損進行治療，并與自體軟骨缺損的臨床效果進行比較。通過比較發(fā)現，兩種不同的軟骨移植方式在排斥率和感染率方面經比較差異均無顯著性意義。但較之自體軟骨移植，異體軟骨移植存在明顯吸收現象。學者們還認為，如果在臨床治療中利用良好的方法對異體軟骨予以妥善保存，則可顯著降低其移植后的吸收現象，達到與自體軟骨移植相同的治療效果。在采用組織工程人工骨進行軟骨修復治療時，基本要素是種子細胞和支架材料。構建過程中，需要用到一定的種子細胞[28-29]。軟骨內無血管、淋巴管和神經，細胞被包埋在由軟骨基質形成的軟骨囊內，因此軟骨細胞具有抗原性弱，不易被機體免疫系統(tǒng)攻擊的特點，而且作為種子細胞，在獲取過程中經過酶的消化、傳代培養(yǎng)及與生物材料的復合培養(yǎng)等系列處理，細胞表面抗原可被進一步消弱和包裹[30]。軟骨的這些免疫學優(yōu)勢使得同種異體軟骨細胞作為組織工程種子細胞成為可能。 此次實驗過程中，選擇具備免疫力的乳兔體內獲得軟骨細胞作為實驗所需的種子細胞。除種子細胞之外，在組織工程軟骨的構建過程中，還需要使用相應的支架材料。在軟骨組織工程生物材料研究中，人工合成和天然類等多種材料都被嘗試用于組織工程化軟骨組織構建，以形成片狀和無中空結構的簡單形態(tài)組織工程化軟骨為主，尚無適宜大塊中空形態(tài)軟骨組織構建需求的生物材料，且普遍存在價格昂貴、加工工藝復雜等問題。因此，繼續(xù)探索理想的軟骨組織工程生物支架材料研究仍是面臨的課題。理想的支架材料應該具有耐拉伸、生物相容性良好、無致炎性、無排斥性和易降解等特點，可為種子細胞提供所需的支撐。本次實驗過程中，選擇使用的支架材料為聚羥基乙酸。聚羥基乙酸具有良好的生物降解性和生物相容性，有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纖性、吸濕性，可作為支架材料，與軟骨細胞復合起來予以應用[31-33]。將支架與軟骨細胞進行復合并進行軟骨缺損修復，植入動物體內一段時間之后，支架材料會逐漸發(fā)生降解[34-35]。本次實驗過程中對聚羥基乙酸支架材料進行掃描電鏡觀察，可以觀察到聚羥基乙酸支架材料具有良好的孔隙結構，說明聚羥基乙酸具有良好的空間結構，可為軟骨細胞的附著和黏附等提供良好的條件[36]。實驗過程中，對標本進行大體觀察可以發(fā)現，植入后4周，實驗組可以觀察到軟骨缺損得到一定的修復，修復區(qū)域未出現壞死，對照組缺損區(qū)域填充有肌肉和結締組織；植入后8周，實驗組軟骨缺損得到進一步修復，且修復界限不明顯，對照組軟骨缺損未得到修復，與周圍正常軟骨之間存在明顯的界限。結果顯示，使用同種異體軟骨細胞-聚羥基乙酸復合物對存在免疫力的乳兔進行喉甲狀軟骨缺損修復，可以獲得良好的軟骨修復效果。Ⅱ型膠原由軟骨細胞分泌，是軟骨的主要膠原成分之一[37-39]。Ⅱ型膠原的表達可反映出機體內軟骨細胞的生長情況[40-51]。此次實驗中，實驗組細胞中富含豐富的Ⅱ型膠原，表明軟骨細胞大量增殖，顯著高于對照組(P < 0.05)，即提示，利用同種異體軟骨細胞-聚羥基乙酸復合物對存在免疫力的乳兔喉甲狀軟骨缺損進行修復，可獲得理想的治療效果。 作者貢獻：喬占清進行實驗設計，實驗實施為喬占清、張俊、馬賽、喬新明，實驗評估為喬占清、馬振亞，資料收集為司遠征，喬占清成文，喬占清、喬新明審校。 利益沖突：所有作者共同認可文章無相關利益沖突。 倫理問題：實驗方案經南陽醫(yī)學高等?？茖W校*附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理部分審核并批準，實驗過程中對動物的使用和處理方法及動物福利等問題均符合倫理要求。 文章查重：文章出版前已經過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。 文章外審：本刊實行雙盲外審制度，文章經國內小同行外審專家審核，符合本刊發(fā)稿宗旨。 作者聲明：文章*作者對研究和撰寫的論文中出現的不端行為承擔責任。論文中涉及的原始圖片、數據(包括計算機數據庫)記錄及樣本已按照有關規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。 文章版權：文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協議。 4 參考文獻 References [1]孫安科,陳文弦,崔鵬程,等.同種異體工程化軟骨的構建和修復甲狀軟骨缺損的實驗研究[J].中華耳鼻咽喉科雜志, 2001,36(4):278-280. 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